沈忠耀－清华大学化工系生物化工研究所

沈忠耀，教授，博士生导师。2001年退休后仍继续参与生物信息与生物催化工程实验室的科学研究及研究生指导工作。在1985年创建了清华大学化工系生物化工研究所，担任第一届所长。在他的带领下，研究所完成了在生物分离工程、动物和植物细胞培养工程以及生物医药工程等多个学科领域的布局。承担了多项国家“七五”和“八五”攻关任务。从1998年起任清华大学生命科学与工程研究院副院长等职务。现任北京吉利大学生命科学与技术学院院长。主要研究领域：生物催化工程，生物分离工程，生物反应工程，超临界流体技术，中药现代化工程等。曾获国家科技进步三等奖、国家教委科技进步二等奖、北京市科技一等奖及中国石化总公司科技三等奖（二次）；已发表学术论文200多篇，授权专利3项，参加编写学术专著3 部。


研究内容

一、        建立蛋白质理性设计平台进行酶的活性与稳定性改造

成功构建了生物信息学方法指导下的蛋白质理性设计平台，用于蛋白酶的催化机制、活性、稳定性等酶学性质的理论模拟及预测，并应用该平台的理论预测结果对酶进行理性设计改造；



二、                                生物与纳米技术的组合应用基础研究

生物技术与纳米技术分别是当前科学研究的两大热点。本课题组与我校材料系的专家合作，致力于从学科交叉的角度出发，进行生物与纳米技术的组合应用基础研究。目前正在进行线状M13重组噬菌体展示纳米金属晶体的研究，以及重组蛋白酶合成纳米金属晶体的探索。



三、                                重组大肠杆菌生物合成透明质酸的应用基础研究

透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）是一种独特的线性大分子粘多糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成。作为一种可吸收、可降解的生物材料，HA因其高度的粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，已广泛应用于临床医学和高级化妆品生产。本课题组与美国麻省理工学院的生物信息与代谢工程实验室合作，经过稀有密码子替换设计，人工合成了透明质酸合成酶基因，进一步在重组大肠杆菌中进行了表达，对大肠杆菌中透明质酸的合成代谢途径及透明质酸合成酶的功能进行了应用基础研究。目前正在进行透明质酸合成酶的结构与功能研究，以及基因重组诺卡氏菌生产透明质酸的研究。



四、                                生物催化法生产医药产品中间体——7-氨基头孢烷酸(7-ACA)

半合成头孢菌素类药物抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低，目前已有60多个品种，占世界抗生素市场的60％以上；而我国仅有11个品种，而且生产技术差距很大。半合成头孢菌素的母核为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。7-ACA的传统生产方法为化学法，一般用到很多腐蚀性药物和有毒溶剂，因此污染严重；另外，化学法还存在反应步骤多、反应条件苛刻、成本高等缺点。与此相反，近年发展起来的生物催化法（酶法）则存在反应条件温和高效、产品质量好、不需有机溶剂、环境污染小等一系列优点。本课题组重点对7-ACA的两步酶法（DAAO氧化酶和GL-7-ACA酰化酶）生产和一步酶法（头孢菌素C酰化酶）生产进行酶的分子克隆和表达以及定点突变和定向进化改造研究。其中，与研究所李强副教授合作开展的两步酶法生产7-ACA的生产工艺已经实现工业化，并通过了河北省科技厅的鉴定。一步酶法生产7-ACA的研究已经取得重大突破。通过头孢菌素C酰化酶基因的从头设计（稀有密码子消除、GC含量削减）和人工合成，头孢菌素C酰化酶的酶活已经达到两步酶法酰化酶的工业化水平。目前正在进一步进行头孢菌素C酰化酶的产物耐受性强化改造及固定化新工艺研究。



五、          生物催化法生产大宗化学品——丙烯酰胺

素有“百业助剂”之称的聚丙烯酰胺在石油、水处理、造纸等领域应用非常广阔，为此，其单体——丙烯酰胺的生物法生产工艺倍受关注。该生物法工艺利用微生物腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺，其生产效率、产物转化率和环境友好性等指标均大大优于原化学法工艺。然而，现有的生物法工艺中仍然存在菌种（腈水合酶）的热稳定性和产物耐受性差、有副产物生成、以及固定化细胞工艺生产效率较低、间歇生产质量不稳定等诸多缺点。为此，本课题组分别提出了针对菌种的基因工程改造策略和针对生产工艺的化学工程改造策略。



1. 基因工程改造策略——腈水合酶基因改造、副产物基因敲除、耐受性强化

成功克隆了诺卡氏菌腈水合酶基因，并通过起始密码子的定点突变在重组大肠杆菌中进行了高活性表达；成功构建了腈水合酶的蛋白质理性设计平台，并应用该平台对腈水合酶的热稳定性进行改造；成功克隆了导致副产物生成的诺卡氏菌酰胺酶基因，并正在对野生诺卡氏菌进行酰胺酶基因敲除的同源重组改造，以构建无副产物生成、且产物合成双倍强化的重组诺卡氏菌。即将进行采用全局转录调控方法强化诺卡氏菌的底物和产物耐受性的研究。



2. 化学工程改造策略——膜反应器的设计、应用与丙烯酰胺的连续化生产

成功设计了膜反应与分离耦合的中空纤维膜生物反应器，并对膜件和膜材料进行了选型与设计；以诺卡氏菌游离细胞为催化剂，实现了丙烯酰胺的单级非稳态、单级拟稳态和多级连续化生产与计算机模拟；该膜生物反应系统已经成功地在企业应用，丙烯酰胺的产物浓度可以达到30％－40％，经济效益显著。





六、          生物催化法生产丙烯酸

丙烯酸是一种非常重要的化工原料中间体。本课题组与北京科技大学的教师合作，通过菌株诱变，获得了高腈水解酶酶活的菌株，可以成功实现以丙烯腈为底物高产丙烯酸（丙烯酸的浓度可累计至414.2 g/L），为目前文献报道的最高值。同时正在进行以乳酸为底物进行丙烯酸的生物催化法生产的应用基础研究；



七、          基因表型的全局转录调控方法研究

高水平方法平台的建立是成功实现具体科研项目研究目标的关键。本课题组将与MIT的前沿研究接轨，进行与生物催化工程相关的基因工程、蛋白质工程和反向代谢工程方法平台的研究，尤其是基于目标表型的基因全局转录调控方法研究以及高效基因敲除方法的研究。



八、          生物催化法生产可生物降解材料——PHA

本研究以当前由塑料垃圾引起的“白色污染”问题越来越严重为背景，以同时具有可完全生物降解性、生物相容性、抗凝血性、压电性及光学活性的新型高分子材料：聚-β-羟基丁酸酯（PHB）为对象，通过PHB合成基因 (phbCAB)、λ噬菌体裂解基因(S-RRz)和透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在重组大肠杆菌中的同时引入，成功解决了PHB生产中原料、发酵和回收成本过高问题，实现了PHB的高密度、高表达生产并大大降低了生产成本，使其具有良好的工业应用前景。



代表性论文及专利：

已公开发表论文100余篇，其中期刊论文54篇，SCI收录18篇，已授权发明专利6项，正在申请发明专利3项。



1．          Zhou H, Yu HM, Luo H, Shi YY, Ma XF, Shen ZY. Inducible and constitutive expression of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase by fusion to maltose-binding protein. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(4), 555-562. (SCI)

2．          YU Hui-Mina, SHI Yuea, LUO Huib, TIAN Zhuo-Linga, ZHU Yan-qina, SHEN Zhong-Yao. An Over Expression and High Efficient Mutation System of a Cobalt-containing Nitrile Hydratase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2006 (43), 80-85. (SCI-111EU)

3．          Hui-Min Yu, Hui Luo, Hang Zhou, Jie Hou, Zhong-Yao Shen. Simultaneous expression of GL-7-ACA acelyase gene and lysis geng of phage λ in a recombinant E. coli.  Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006 (43), 118-123. (SCI-111EU)

4．          SUN Ruifeng, YU Huimin，LUO Hui, SHEN Zhongyao. Thermodynamic Study on Chiral Separation Process Using Molecular Imprinting. Acta Chimica Sinica, 2005, 63(3): 189-195. (SCI-895GA)

5．          Sun Xudong, Yu Huimin, Shi Yue, Shen Zhongyao. Quick Analyses of Acrylamide and Acrylonitrile by a New Refraction Method and Timed Gas Chromatography.  Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2005, 33 (12): 1737-1739. (SCI-999IF)

6．          SUN Ruifeng, YU Huimin，LUO Hui, SHEN Zhongyao. Construction and application of a stoichiometric displacement model for retention in chiral recognition of molecular imprinting. Journal of Chromatography A. 2004, 1055(1-2) (Nov.): 1-9. (SCI- 868TL)

7．          Sun Xudong, Shi Yue, Yu Huimin, Shen Zhongyao. Bioconversion of acrylonitrile to acrylamide using hollow-fiber membrane bioreactor system. Biochemical Engineering Journal. 2004, 18(3): 239-243. (SCI-822DT)

8．          Hui LUO, Huimin YU, Qiang LI, Zhongyao SHEN. Cloning and Co-Expression of D-amino Acid Oxidase and Glutaryl-7-amino cephalosporanic Acid Acylase Genes in Escherichia coli. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 35(6-7), 514-518. (SCI-873ER)

9．          Yue SHI, Huimin YU, Xudong SUN, Zhuoling TIAN, Zhongyao SHEN. Cloning of the Nitrile Hydratase Gene from Nocardia sp. in Escherichia coli and Pichia pastoris and Its Functional Expression Using Site-directed Mutagenesis. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 35(6-7), 557-562. (SCI-873ER)

10．      Hui Luo, Qiang Li, Huimin Yu, Zhongyao Shen. Construction and application of fusion proteins of D-amino acid oxidase and GL-7-ACA acylase for direct bioconversion of cephalosporin C to 7-ACA. Biotechnology Letters. 2004, 26(11): 939-945. (SCI-825ZY)

11．      Huimin YU, Yue SHI, Jin YIN, Zhongyao SHEN and Shengli YANG. Genetic strategy for solving chemical engineering problems in biochemical engineering. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2003, 78(2/3), 283-286. (SCI-653CE)

12．      Huimin Yu, Yue Shi, Xudong Sun, Hui Luo, Zhongyao Shen. Effect of poly(β-hydroxybutyrate) accumulation on the stability of a recombinant plasmid in Escherichia coli. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2003, 96(2):179-183. (SCI-736EF)

13．      Yu Huimin, Shi Yue, Zhang Yanping, Yang Shengli, Shen Zhongyao. Effect of Vitreoscilla hemoglobin biosynthesis in Escherichia coli on production of poly(β-hydroxybutyrate) and fermentative parameters.  FEMS Microbiology letters, 2002, 214 (2), 223-227. (SCI-601UV)

14．      Yu Huimin, Shi Yue, Yin Jin, Shen Zhongyao, Yang Shengli.  Simultaneous expression of Vitreoscilla globin gene and lytic genes of phage l in a novel recombinant Escherichia coli used for production of PHB. Chinese Journal of Chemical Engineering, 2001, 9(4)：407-411. (SCI-504CL)

15．      Yu Huimin, Yin Jin, Li Hongqi, Yang Shengli, Shen Zhongyao. Construction and selection of the novel recombinant Escherichia coli strain for poly(β-hydroxybutyrate) production.  Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000，89(4), 307～311. (SCI-321UC)