NCCLS M44-P纸片扩散法酵母菌敏感试验建议指南介绍

美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）M44-P酵母菌纸片扩散法敏感性试验方案，制定了氟康唑和沃尔康唑质控菌株的参考范围及氟康唑的抑菌圈直径解释标准。研究报告已证实氟康唑对酵母菌的纸片扩散法敏感试验有较好的重复性，可准确地检测酵母菌对氟康唑的敏感性。
一、 试验材料
1、设备：35℃孵箱，0.5号麦氏标准比浊管。
2、试剂
2.1氟康唑 (25μg/片)和沃尔康唑(1μg/片)纸片。未开封的纸片小于-20以下保存。
2.2无菌棉试子，无菌生理盐水，肉汤。
2.3含2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝的M-H琼脂。
附：含2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝的M-H琼脂制备方法。
方法1：在1000mlM－H琼脂中，加入100微升美蓝（Methylene blue）贮存液（0.1g美蓝加20ml无菌水即为美蓝贮贮液）和20g葡萄糖。121℃，15min高压菌，水浴55℃倒4mm厚平皿备用。
方法2：
A、美蓝贮存液（5mg/ml）：称取0.1g美蓝至20ml无菌水中，温热至溶解，不能过热。
B、葡萄糖贮存液（0.4g/ml）：称取40g葡萄糖至100ml无菌水中，温热混匀至溶解。
倾注补充物至M－H琼脂平皿表面法的步骤：
（1） 取200微升溶液A至100ml溶液B中，制备成葡萄糖美蓝贮存液，终浓度含40%葡萄糖和10μg/ml美蓝。
（2） 分装葡萄糖美蓝贮存液3.5ml/瓶或1.5ml/瓶。
（3） 121℃，15min高压灭菌。
（4） 室温贮存，密封无菌操作可长期备用。
（5） 倾注3.5ml葡萄糖美蓝贮存液至直径150mm M-H平皿或倾注1.5ml至90mm　M－H平皿表面上，倾斜晃动平皿均匀涂布。在涂布酵母菌悬液之前确保葡萄糖美蓝贮存液完全吸收，采用室温或孵箱孵育吸收4-24h，在洁净台内吹干备用。

二、 酵母菌纸片扩散法敏感试验方法
1、制备酵母菌悬液：挑取大约5个菌落至5ml生理盐水或无菌水中，旋摇成均匀的菌悬液。
2、调酵母菌悬液浊度：用无菌生理盐水或水调整浊度至0.5麦氏标准比浊管浊度，方法同标准的细菌纸片扩散法，酵母菌量约为1－5×10的6次方/ml。
3、接种平板：在酵母菌悬液中浸湿无菌棉试子，在试管内壁液面上方通过旋转棉试子挤出多余的酵母菌液。用浸湿酵母菌液的棉试子从3个不同方向在含葡萄糖美蓝的M－H琼脂平板上均匀涂布。待琼脂吸收酵母菌液5－15分钟后。在接种酵母菌液的平板上贴氟康唑和沃尔康唑纸片，轻轻压一下，确保纸片贴在琼脂表面上。
4、孵育：35℃孵育20－24h后读取结果。如果24h生长不足，延长至48h.
5、结果判读和解释：在抑菌圈边缘或内部的极微小菌落（大约小于20%菌落生长）可忽略不计。氟康唑纸片扩散法解释标准和相对应最小抑菌浓度如下：
　　　　　　　抑菌圈直径（mm） MIC（μg/ml）
敏感（S）　　　　　≥19　　　　　　　　≤8
剂量依赖敏感（SDD）15－18　　　　　　16－32
耐药（R）　　　　　≤14　　　　　　　　≥64

（剂量依赖敏感（SDD）:缓冲区，防止小的，无法控制的，技术因素误差，可接近血液和组织的药物浓度水平，疗效较敏感株反应慢，更适合毒性小的药物。）

沃尔康唑纸片法的解释标准还没有建立。

6、质控：氟康唑和沃尔康唑对标准菌株抑菌圈直径（mm）的质控允许范围如下：

标准菌株　　　　　　氟康唑25μg　　沃尔康唑1μg
白色念珠菌ATCC90028　　28－39　　　　31－42
近平滑念珠菌ATCC22019　22－33　　　　28－37
热带念珠菌ATCC750　　　26－37
克柔念珠菌ATCC6258　　　　　　　　　16－25