Escherichia coli表达系统简介

1 Escherichia coli表达系统简介
Escherichia coli作为表达系统主要有以下几个特点：（1）分子水平上的遗传背景较为清晰；（2）基因工程方法已趋于完善；（3）比生长速率高；（4）表达系统多样、有效；（5）生长及表达外源蛋白的培养基廉价。尽管有多种优点，但也有一些不利方面，例如：内毒素的产生，无翻译后修饰及没有有效的分泌系统，在葡萄糖代谢中常常产生代谢副产物（乙酸等）。这些副产物的形成直接影响菌体细胞的生长以及目标产物的产率，常常在高密度培养过程中遇见。
2 表达载体的基本元件
在设计重组表达系统时有许多关键元件是不可缺少的。这些元件包括复制启始子（ori）、抗生素抗性标志、转录启动子、翻译起始区（TIRs）、转录及翻译终止子。

原核表达载体的基本框架：由-35和-10序列组成的tac启动子（P），其中由17个碱基相隔。箭头代表了转录的方向。核糖体结合位点（RBS）由Shine-Dalgarno(SD)序列组成，富含AT碱基，其最优长度约为8个碱基的序列，这段SD与16S核糖体RNA的3，末端相互作用。三个起始密码子及三个终止密码子如图所示。在Escherichia coli中，后面紧随碱基U的UAA密码子是最有效的转录终止序列。抑制元通过编码调节基因（R）来调节启动子的活性，抑制元既能存在载体中也可整合在宿主染色体中。转录终止子（TT）起着稳定mRNA和载体的作用。抗生素抗性基因主要用于载体片段的选择，复制子决定了载体拷贝数。
启动子
在Escherichia coli表达系统中，许多不同类型的启动子影响外源基因的表达效率。一个合适的高表达外源基因的启动子应符合以下几点：第一，必须是较强的启动子，表达效率在10~30%之间（目标蛋白占菌体总蛋白）。第二，由启动子控制的本底转录很低，这在表达一些对宿主有毒害的外源蛋白尤为重要。第三，启动子能够由一些简单及经济合算的方式诱导启动。温度诱导及化合物诱导已被大量使用。IPTG是一种对杂交的tac和trc启动子强力诱导剂，然而，对大规模生产人类药用蛋白来说，IPTG不是一种理想的诱导剂，主要是因为它价格昂贵又具有毒副作用的原因。温度诱导是一种较为新颖的诱导方式，它不仅经济合算操作简单而且在生产过程中不会添加有害物。在本课题研究的表达系统中，也是一种温度诱导系统。
抗生素抗性标志
在表达的载体上常常构建对氨苄青霉素(ampicillin)、卡那霉素（kanamycin）、氯霉素（chloramphenicol）或者四环素（tetracycline）具有抗性的抗生素抗性标志。由于载体上已构建有bla基因，表达产生β-内酰胺酶(β-lactamase )被分泌到细胞间隙中，催化水解β-内酰胺环，表现出对氨苄青霉素抗性。在培养基中氨苄青霉素易于降解，除了β-内酰胺酶的影响外，还有在高密度培养过程中，分泌的有机酸对氨苄青霉素起降解作用。Escherichia coli宿主表达外源蛋白的宿主遗传背景是非常重要的。表达宿主应该是蛋白酶缺陷菌株，以便维持质粒稳定性和赋予相关表达系统的遗传元件（例如DE3）。
mRNAs的稳定性
Escherichia coli mRNA是相当不稳定，其半衰期为30秒到20分钟。主要酶包括mRNA降解酶、核酸外切酶（核糖核酸酶II和多核苷酸磷酸化酶）、
核酸内切酶、核糖核酸酶。核糖核酸酶的反应活性位于蛋白的氨基末端，然而，它的羧基末端作为支架起着组装高效RNA降解酶的作用。另一方面，出现在某些转录子UTR和依赖rho中终结子稳定的二级结构都能提高mRNA的稳定性。然而，在mRNA3’末端上借助足够多的poly(A)聚合酶来添加多聚腺苷酸将有助于防止RNaseII和PNPase的降解。而且，仅仅在mRNAs多出一段多聚腺苷酸不将影响重组蛋白的表达。把ompAUTR融合到外源mRNAs将提高它的半衰期。有数据表明，在产物形成的过程中，刚开始其生成速率受翻译水平的限制。四小时后mRNA及产物水平下降，转录成为了限速步骤。

3 影响Escherichia coli表达外源蛋白的因素
宿主菌基因型
Escherichia coli基因型的不同，可以使处在相同的培养条件下，表现出不同的特性。Luli等研究了相同条件下不同宿主菌在补料分批培养中生物量的积累，E.coli JM105的菌体密度较高（30g/L），MC10609则相对较低（10g/L）。Walle等对不同菌体的产酸能力进行了研究，结果表明，相同条件下，E.coli JM109的产酸量是BL21的四倍。
质粒载体
重组Escherichia coli中构建的质粒载体也对外源基因的表达产生很大影响。质粒的拷贝数越多，重组蛋白的产量也就相应越高。稳定的质粒也是外源蛋白高表达的必要条件。常用的质粒如pET、pSC、pPBB都具有高拷贝数、多插入位点、稳定性较强等优点。值得注意的是，菌体的比生长率过高，会引起质粒的丢失，从而影响外源蛋白的表达。通常，我们可以用增加筛选压力的方法予以克服。
诱导系统
常用的诱导系统有λ噬菌体PL启动子、trp-lac杂合启动子和T7噬菌体启动子等几种。其中，λ噬菌体PL启动子是用温度进行诱导的启动子，易于控制，但耗能较多；trp-lac杂合启动子是最为常用的诱导系统，该系统需加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，可专一诱导目的蛋白，不受干扰，但诱导物——异丙基硫代半乳糖苷比较昂贵。T7噬菌体启动子是一种新型诱导系统，可表达一些特殊基因。